Heterogeneity sa mga fiber sa kaunuran sa tawo lapas sa myosin heavy chain

Salamat sa pagbisita sa nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar ang paggamit sa pinakabag-ong bersyon sa browser (o pag-disable sa compatibility mode sa Internet Explorer). Dugang pa, aron masiguro ang padayon nga suporta, kini nga site walay mga style ug JavaScript.
Ang kaunoran sa kalabera usa ka heterogeneous nga tisyu nga gilangkoban kasagaran sa mga myofibril, nga sa mga tawo kasagarang giklasipikar sa tulo ka klase: usa ka "hinay" (tipo 1) ug duha ka "paspas" (tipo 2A ug 2X). Bisan pa, ang heterogeneity tali ug sulod sa tradisyonal nga mga tipo sa myofibril wala pa kaayo masabti. Gigamit namo ang transcriptomic ug proteomic nga mga pamaagi sa 1050 ug 1038 ka indibidwal nga myofibril gikan sa vastus lateralis sa tawo, matag usa. Ang pagtuon sa proteomic naglakip sa mga lalaki, ug ang pagtuon sa transcriptomic naglakip sa 10 ka lalaki ug 2 ka babaye. Gawas pa sa mga isoform sa myosin heavy chain, among giila ang mga metabolic protein, ribosomal protein, ug cellular junctional protein isip mga tinubdan sa multidimensional intermyofibril variability. Dugang pa, bisan pa sa pag-ila sa mga pungpong sa hinay ug paspas nga mga lanot, ang among datos nagsugyot nga ang type 2X fibers dili mailhan sa phenotypically gikan sa ubang mga fast-twitch fibers. Dugang pa, ang klasipikasyon nga gibase sa myosin heavy chain dili igo aron ihulagway ang myofiber phenotype sa nemaline myopathies. Sa kinatibuk-an, ang among datos nagsugyot og multidimensional myofiber heterogeneity, nga adunay mga tinubdan sa kalainan nga milapas pa sa myosin heavy chain isoforms.
Ang cellular heterogeneity usa ka kinaiyanhong bahin sa tanang biyolohikal nga sistema, nga nagtugot sa mga selula sa pag-espesyalisar aron matubag ang lain-laing mga panginahanglan sa mga tisyu ug mga selula.1 Ang tradisyonal nga panglantaw sa skeletal muscle fiber heterogeneity mao nga ang mga motor neuron nagtino sa tipo sa fiber sulod sa usa ka motor unit, ug nga ang tipo sa fiber (ie, tipo 1, tipo 2A, ug tipo 2X sa mga tawo) gitino sa mga kinaiya sa myosin heavy chain (MYH) isoforms.2 Kini sa sinugdanan gibase sa ilang pH ATPase instability,3,4 ug sa ulahi sa ilang molecular expression sa MYH.5 Bisan pa, uban sa pag-ila ug sunod nga pagdawat sa "sinagol" nga mga fiber nga nag-co-express sa daghang MYH sa lain-laing mga proporsyon, ang mga fiber sa skeletal muscle nagkadaghan nga gitan-aw isip usa ka continuum imbes nga lahi nga mga tipo sa fiber.6 Bisan pa niini, ang natad nagsalig gihapon sa MYH isip pangunang classifier alang sa myofiber classification, usa ka panglantaw nga lagmit naimpluwensyahan sa mga limitasyon ug hinungdanon nga mga bias sa sayo nga mga pagtuon sa ilaga kansang mga profile sa ekspresyon sa MYH ug ang gilapdon sa mga tipo sa fiber lahi sa mga tawo.2 Ang sitwasyon labi nga komplikado sa kamatuoran nga ang lainlaing mga kaunuran sa skeletal sa tawo nagpakita sa lainlaing mga tipo sa fiber.7 Ang vastus lateralis usa ka sinagol nga kaunuran nga adunay intermediate (ug busa representante) nga profile sa ekspresyon sa MYH.7 Dugang pa, ang kadali sa pagkuha og sample naghimo niini nga labing gitun-an nga kaunuran sa mga tawo.
Busa, ang walay gidapigan nga imbestigasyon sa pagkalainlain sa mga lanot sa kaunuran sa kalabera gamit ang gamhanang mga himan nga "omics" kritikal apan mahagiton usab, tungod sa bahin sa multinucleated nga kinaiya sa mga lanot sa kaunuran sa kalabera. Bisan pa, ang mga teknolohiya sa transcriptomics8,9 ug proteomics10 nakaagi sa usa ka rebolusyon sa pagkasensitibo sa bag-ohay nga mga tuig tungod sa lainlaing mga pag-uswag sa teknolohiya, nga nagtugot sa pag-analisar sa kaunuran sa kalabera sa resolusyon nga single-fiber. Ingon usa ka sangputanan, hinungdanon nga pag-uswag ang nahimo sa pag-ila sa pagkalainlain sa single-fiber ug ang ilang tubag sa atrophic stimuli ug pagkatigulang11,12,13,14,15,16,17,18. Importante, kini nga mga pag-uswag sa teknolohiya adunay mga klinikal nga aplikasyon, nga nagtugot alang sa mas detalyado ug tukma nga pag-ila sa dysregulation nga nalangkit sa sakit. Pananglitan, ang pathophysiology sa nemaline myopathy, usa sa labing kasagaran nga napanunod nga mga sakit sa kaunuran (MIM 605355 ug MIM 161800), komplikado ug makalibog.19,20 Busa, ang mas maayo nga pag-ila sa dysregulation sa mga lanot sa kaunuran sa kalabera mahimong mosangpot sa hinungdanon nga mga pag-uswag sa atong pagsabot niini nga sakit.
Naghimo kami og mga pamaagi para sa transcriptomic ug proteomic analysis sa single skeletal muscle fibers nga mano-mano nga gi-isolate gikan sa human biopsy specimens ug gigamit kini sa liboan ka mga fibers, nga nagtugot kanamo sa pag-imbestiga sa cellular heterogeneity sa human skeletal muscle fibers. Atol niini nga trabaho, among gipakita ang gahum sa transcriptomic ug proteomic phenotyping sa muscle fibers ug giila ang metabolic, ribosomal, ug cellular junctional proteins isip mga importanteng tinubdan sa interfiber variability. Dugang pa, gamit kini nga proteomic workflow, among gihulagway ang clinical relevance sa nematode myopathy sa single skeletal muscle fibers, nga nagpadayag sa usa ka coordinated shift padulong sa non-oxidative fibers nga independente sa fiber type base sa MYH.
Aron imbestigahan ang heterogeneity sa mga lanot sa kaunuran sa kalansay sa tawo, naghimo kami og duha ka workflow aron mahimo ang transcriptome ug proteome analysis sa single skeletal muscle fibers (Figure 1A ug Supplementary Figure 1A). Naghimo ug nag-optimize kami og daghang methodological nga mga lakang, gikan sa pagtipig sa sample ug pagpreserbar sa integridad sa RNA ug protina hangtod sa pag-optimize sa throughput alang sa matag pamaagi. Alang sa transcriptome analysis, kini nakab-ot pinaagi sa pagsal-ot sa sample-specific molecular barcodes sa inisyal nga lakang sa reverse transcription, nga nagtugot sa 96 ka mga lanot nga ma-pool alang sa episyente nga downstream processing. Ang mas lawom nga sequencing (±1 milyon nga reads matag fiber) kon itandi sa tradisyonal nga single-cell approaches dugang nga nagpayaman sa transcriptome data. 21 Alang sa proteomics, migamit kami og mubo nga chromatographic gradient (21 minutos) nga giubanan sa DIA-PASEF data acquisition sa usa ka timsTOF mass spectrometer aron ma-optimize ang giladmon sa proteome samtang gipadayon ang taas nga throughput. 22,23 Aron imbestigahan ang heterogeneity sa himsog nga mga lanot sa kaunuran sa kalabera, among gihulagway ang mga transcriptome sa 1,050 ka indibidwal nga mga lanot gikan sa 14 ka himsog nga mga donor sa hamtong ug ang mga proteome sa 1,038 ka mga lanot gikan sa 5 ka himsog nga mga donor sa hamtong (Supplementary Table 1). Niini nga papel, kini nga mga dataset gitawag nga 1,000-fiber transcriptomes ug proteome, matag usa. Ang among pamaagi nakamatikod og total nga 27,237 ka mga transcript ug 2,983 ka mga protina sa 1,000-fiber transcriptomic ug proteomic analyses (Figure 1A, Supplementary Datasets 1–2). Human sa pagsala sa mga transcriptomic ug proteomic datasets para sa >1,000 ka nakita nga mga gene ug 50% nga balido nga mga kantidad matag fiber, ang sunod nga mga bioinformatics analyses gihimo para sa 925 ug 974 ka mga lanot sa transcriptome ug proteome, matag usa. Human sa pagsala, usa ka aberids nga 4257 ± 1557 ka gene ug 2015 ± 234 ka protina (mean ± SD) ang nakita matag fiber, nga adunay limitado nga inter-individual variability (Supplementary Figures 1B–C, Supplementary Datasets 3–4). Bisan pa, ang within-subject variability mas klaro sa mga partisipante, lagmit tungod sa mga kalainan sa RNA/protein yield tali sa mga fiber nga lain-laing gitas-on ug cross-sectional areas. Alang sa kadaghanan sa mga protina (>2000), ang coefficient of variation ubos sa 20% (Supplementary Figure 1D). Ang duha ka pamaagi nagtugot sa pagkuha sa usa ka halapad nga dynamic range sa mga transcript ug protina nga adunay taas nga gipahayag nga mga pirma nga importante alang sa muscle contraction (pananglitan, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Supplementary Figures 1E–F). Kadaghanan sa mga nailhan nga feature komon tali sa transcriptomic ug proteomic datasets (Supplementary Figure 1G), ug ang mean UMI/LFQ intensities niini nga mga feature adunay makatarunganon nga maayong correlation (r = 0.52) (Supplementary Figure 1H).
Ang workflow sa transcriptomics ug proteomics (gihimo gamit ang BioRender.com). BD Dynamic range curves para sa MYH7, MYH2, ug MYH1, ug gikalkulo nga mga threshold para sa pag-assign sa fiber type. E, F Distribusyon sa MYH expression sa mga fiber sa transcriptomics ug proteomics datasets. G, H Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP) plots para sa transcriptomics ug proteomics nga gikoloran sa MYH-based fiber type. I, J Feature plots nga nagpakita sa MYH7, MYH2, ug MYH1 expression sa transcriptomics ug proteomics datasets.
Sa sinugdanan, among gitinguha nga i-assign ang MYH-based fiber type sa matag fiber gamit ang usa ka optimized nga pamaagi nga nagpahimulos sa taas nga sensitivity ug dynamic range sa MYH expression sa omics datasets. Ang mga nangaging pagtuon migamit og arbitraryong mga threshold aron i-label ang mga fiber isip puro nga type 1, type 2A, type 2X, o mixed base sa usa ka fixed percentage sa expression sa lain-laing MYHs11,14,24. Migamit kami og lahi nga pamaagi diin ang expression sa matag fiber gi-rank sa MYHs nga among gigamit sa pag-type sa mga fiber: MYH7, MYH2, ug MYH1, nga katumbas sa type 1, type 2A, ug type 2X fibers, matag usa. Dayon among gikalkulo sa matematika ang mas ubos nga inflection point sa matag resulta nga kurba ug gigamit kini isip threshold aron i-assign ang mga fiber isip positibo (labaw sa threshold) o negatibo (ubos sa threshold) para sa matag MYH (Figure 1B–D). Kini nga datos nagpakita nga ang MYH7 (Figure 1B) ug MYH2 (Figure 1C) adunay mas lahi nga on/off expression profiles sa RNA level kon itandi sa protein level. Sa tinuod lang, sa lebel sa protina, gamay ra kaayo nga mga lanot ang wala mag-express sa MYH7, ug walay lanot nga adunay 100% nga ekspresyon sa MYH2. Sunod, migamit kami og gitakda nang daan nga mga limitasyon sa ekspresyon aron i-assign ang mga tipo sa lanot nga nakabase sa MYH sa tanang lanot sa matag dataset. Pananglitan, ang mga lanot nga MYH7+/MYH2-/MYH1- gi-assign sa tipo 1, samtang ang mga lanot nga MYH7-/MYH2+/MYH1+ gi-assign sa sinagol nga tipo 2A/2X (tan-awa ang Supplementary Table 2 para sa kompletong deskripsyon). Sa paghiusa sa tanang lanot, among naobserbahan ang parehas nga distribusyon sa mga tipo sa lanot nga nakabase sa MYH sa lebel sa RNA (Figure 1E) ug protina (Figure 1F), samtang ang relatibong komposisyon sa mga tipo sa lanot nga nakabase sa MYH managlahi sa matag indibidwal, sama sa gilauman (Supplementary Figure 2A). Kadaghanan sa mga lanot giklasipikar nga puro nga tipo 1 (34–35%) o tipo 2A (36–38%), bisan kung daghang gidaghanon sa sinagol nga tipo 2A/2X nga mga lanot ang nakit-an usab (16–19%). Usa ka talagsaong kalainan mao nga ang puro nga type 2X fibers makita lamang sa lebel sa RNA, apan dili sa lebel sa protina, nga nagsugyot nga ang paspas nga ekspresyon sa MYH labing menos partially nga gi-regulate pagkahuman sa transkripsyon.
Among gi-validate ang among pamaagi sa pag-type sa MYH fiber nga nakabase sa proteomics gamit ang antibody-based dot blotting, ug ang duha ka pamaagi nakab-ot ang 100% nga kasabutan sa pag-ila sa puro nga type 1 ug type 2A nga mga fiber (tan-awa ang Supplementary Figure 2B). Bisan pa, ang pamaagi nga nakabase sa proteomics mas sensitibo, mas episyente sa pag-ila sa gisagol nga mga fiber, ug pag-ihap sa proporsyon sa matag MYH gene sa matag fiber. Kini nga datos nagpakita sa kaepektibo sa paggamit sa usa ka obhetibo, sensitibo kaayo nga pamaagi nga nakabase sa omics aron mailhan ang mga tipo sa fiber sa skeletal muscle.
Gigamit dayon namo ang hiniusa nga impormasyon nga gihatag sa transcriptomics ug proteomics aron obhetibong klasipikahon ang mga myofiber base sa ilang kompletong transcriptome o proteome. Gamit ang uniform manifold approximation and projection (UMAP) nga pamaagi aron makunhuran ang dimensionality ngadto sa unom ka pangunang sangkap (Supplementary Figures 3A–B), among nakita ang pagkalainlain sa myofiber sa transcriptome (Figure 1G) ug proteome (Figure 1H). Talalupangdon nga ang mga myofiber wala gigrupo pinaagi sa mga partisipante (Supplementary Figures 3C–D) o mga adlaw sa pagsulay (Supplementary Figure 3E) sa mga dataset sa transcriptomics o proteomics, nga nagsugyot nga ang within-subject variability sa mga lanot sa kaunuran sa kalabera mas taas kaysa sa between-subject variability. Sa UMAP plot, duha ka managlahing cluster nga nagrepresentar sa "paspas" ug "hinay" nga mga myofiber ang mitumaw (Figures 1G–H). Ang MYH7+ (hinay) nga myofibers gipundok sa positibong poste sa UMAP1, samtang ang MYH2+ ug MYH1+ (paspas) nga myofibers gipundok sa negatibong poste sa UMAP1 (Mga Hulagway 1I–J). Bisan pa, walay kalainan nga gihimo tali sa mga tipo sa fast-twitch fiber (ie, tipo 2A, tipo 2X, o sinagol nga 2A/2X) base sa ekspresyon sa MYH, nga nagsugyot nga ang MYH1 (Hulagway 1I–J) o uban pang klasikal nga 2X myofiber markers sama sa ACTN3 o MYLK2 (Supplementary Figures 4A–B) nga ekspresyon wala magpalahi tali sa lainlaing mga tipo sa myofiber kung gikonsiderar ang tibuuk nga transcriptome o proteome. Dugang pa, kung itandi sa MYH2 ug MYH7, pipila ra ka mga transcript o protina ang positibo nga nakig-uban sa MYH1 (Supplementary Figs. 4C–H), nga nagsugyot nga ang kadagaya sa MYH1 wala hingpit nga nagpakita sa transcriptome/proteome sa myofiber. Susamang mga konklusyon ang nakab-ot sa pagtimbang-timbang sa sinagol nga ekspresyon sa tulo ka MYH isoforms sa lebel sa UMAP (Supplementary Figs. 4I–J). Busa, samtang ang 2X fibers mailhan sa lebel sa transcript base sa MYH quantification lamang, ang MYH1+ fibers dili mailhan gikan sa ubang fast fibers kon hunahunaon ang tibuok transcriptome o proteome.
Isip inisyal nga pagsuhid sa heterogeneity sa hinay nga fiber lapas sa MYH, among gisusi ang upat ka natukod nga slow fiber type-specific proteins: TPM3, TNNT1, MYL3, ug ATP2A22. Ang mga subtype sa hinay nga fiber nagpakita og taas, bisan dili perpekto, nga Pearson correlations sa MYH7 sa parehong transcriptomics (Supplementary Figure 5A) ug proteomics (Supplementary Figure 5B). Gibana-bana nga 25% ug 33% sa hinay nga fibers wala giklasipikar nga puro nga hinay nga fibers sa tanan nga gene/protein subtypes sa transcriptomics (Supplementary Figure 5C) ug proteomics (Supplementary Figure 5D), matag usa. Busa, ang klasipikasyon sa hinay nga fiber nga gibase sa daghang gene/protein subtypes nagpaila sa dugang nga pagkakomplikado, bisan sa mga protina nga nahibal-an nga fiber type-specific. Kini nagsugyot nga ang klasipikasyon sa fiber nga gibase sa isoforms sa usa ka pamilya sa gene/protein mahimong dili igo nga nagpakita sa tinuod nga heterogeneity sa mga fiber sa skeletal muscle.
Aron mas masusi ang phenotypic variability sa mga fiber sa skeletal muscle sa tawo sa sukdanan sa tibuok omics model, naghimo kami og unbiased dimensionality reduction sa datos gamit ang principal component analysis (PCA) (Figure 2A). Sama sa UMAP plots, walay partisipante o testing day nga nakaimpluwensya sa fiber clustering sa PCA level (Supplementary Figures 6A–C). Sa duha ka datasets, ang MYH-based fiber type gipasabot sa PC2, nga nagpakita og cluster sa slow-twitch type 1 fibers ug ikaduhang cluster nga adunay fast-twitch type 2A, type 2X, ug mixed 2A/2X fibers (Figure 2A). Sa duha ka datasets, kining duha ka cluster konektado sa gamay nga gidaghanon sa mixed type 1/2A fibers. Sama sa gilauman, ang overrepresentation analysis sa mga main PC drivers nagpamatuod nga ang PC2 gimaneho sa contractile ug metabolic signatures (Figure 2B ug Supplementary Figures 6D–E, Supplementary Datasets 5–6). Sa kinatibuk-an, ang MYH-based fiber type nakit-an nga igo na aron ipasabut ang padayon nga pagkalainlain sa PC2, gawas sa gitawag nga 2X fibers nga giapod-apod sa tibuuk nga transcriptome sulod sa fast cluster.
A. Mga plot sa Principal component analysis (PCA) sa mga transcriptome ug proteome dataset nga gikolor sumala sa tipo sa fiber base sa MYH. B. Pag-analisa sa pagpayaman sa transcript ug protein drivers sa PC2 ug PC1. Gihimo ang statistical analysis gamit ang clusterProfiler package ug Benjamini-Hochberg adjusted p-values. C, D. Mga plot sa PCA nga gikolor sumala sa intercellular adhesion gene ontology (GO) nga mga termino sa transcriptome ug costamere GO nga mga termino sa proteome. Ang mga pana nagrepresentar sa mga transcript ug protein driver ug sa ilang mga direksyon. E, F. Uniform manifold approximation and projection (UMAP) feature plots sa mga clinically relevant features nga nagpakita sa expression gradients nga independente sa hinay/paspas nga tipo sa fiber. G, H. Mga korelasyon tali sa PC2 ug PC1 drivers sa mga transcriptome ug proteome.
Sa wala damha, ang MYH-based myofiber type nagpatin-aw lamang sa ikaduha nga labing taas nga degree sa variability (PC2), nga nagsugyot nga ang ubang mga biological nga hinungdan nga wala’y kalabotan sa MYH-based myofiber type (PC1) adunay hinungdanon nga papel sa pag-regulate sa heterogeneity sa fiber sa skeletal muscle. Ang overrepresentation analysis sa mga nag-unang driver sa PC1 nagpadayag nga ang variability sa PC1 panguna nga gitino sa cell-cell adhesion ug ribosome content sa transcriptome, ug costameres ug ribosomal proteins sa proteome (Figure 2B ug Supplementary Figures 6D–E, Supplementary Data Set 7). Sa skeletal muscle, ang costameres nagkonektar sa Z-disc sa sarcolemma ug nalambigit sa force transmission ug signaling. 25 ka Annotated PCA plots gamit ang cell-cell adhesion (transcriptome, Figure 2C) ug costamere (proteome, Figure 2D) nga mga feature nagpadayag sa usa ka kusog nga left shift sa PC1, nga nagpakita nga kini nga mga feature gipayaman sa pipila ka mga fiber.
Usa ka mas detalyado nga pagsusi sa myofiber clustering sa lebel sa UMAP nagpadayag nga kadaghanan sa mga bahin nagpakita og myofiber type-independent MYH-based expression gradient imbes nga myofiber subcluster-specific. Kini nga continuity naobserbahan alang sa daghang mga gene nga nalangkit sa mga kondisyon sa patolohiya (Figure 2E), sama sa CHCHD10 (neuromuscular disease), SLIT3 (muscle atrophy), CTDNEP1 (muscle disease). Kini nga continuity naobserbahan usab sa tibuok proteome, lakip ang mga protina nga nalangkit sa mga sakit sa neurological (UGDH), insulin signaling (PHIP), ug transcription (HIST1H2AB) (Figure 2F). Sa kinatibuk-an, kini nga datos nagpakita sa continuity sa fiber type-independent slow/fast twitch heterogeneity sa lain-laing mga myofiber.
Makapainteres, ang mga driver gene sa PC2 nagpakita og maayong transcriptome-proteome correlation (r = 0.663) (Figure 2G), nga nagsugyot nga ang hinay ug paspas nga pagkibot nga mga tipo sa fiber, ug labi na ang contractile ug metabolic nga mga kabtangan sa mga lanot sa kaunuran sa kalabera, gi-regulate sa transcriptionally. Bisan pa, ang mga driver gene sa PC1 wala magpakita og transcriptome-proteome correlation (r = -0.027) (Figure 2H), nga nagsugyot nga ang mga kalainan nga wala’y kalabotan sa hinay/paspas nga pagkibot nga mga tipo sa fiber kadaghanan gi-regulate pagkahuman sa transkripsyon. Tungod kay ang mga kalainan sa PC1 panguna nga gipasabut sa mga termino sa ribosomal gene ontology, ug tungod kay ang mga ribosome adunay hinungdanon ug espesyal nga papel sa selula pinaagi sa aktibong pag-apil ug pag-impluwensya sa paghubad sa protina,31 among gisugdan ang pag-imbestiga niining wala damha nga ribosomal heterogeneity.
Una namong gikoloran ang proteomics principal component analysis plot sumala sa relatibong kadagaya sa mga protina sa termino sa GOCC nga "cytoplasmic ribosome" (Figure 3A). Bisan tuod kini nga termino gipayaman sa positibo nga bahin sa PC1, nga miresulta sa gamay nga gradient, ang mga ribosomal nga protina nagduso sa pagbahinbahin sa duha ka direksyon sa PC1 (Figure 3A). Ang mga ribosomal nga protina nga gipayaman sa negatibo nga bahin sa PC1 naglakip sa RPL18, RPS18, ug RPS13 (Figure 3B), samtang ang RPL31, RPL35, ug RPL38 (Figure 3C) mao ang mga nag-unang nagduso sa positibo nga bahin sa PC1. Makapainteres, ang RPL38 ug RPS13 taas nga gipahayag sa skeletal muscle kon itandi sa ubang mga tisyu (Supplementary Figure 7A). Kini nga mga lahi nga ribosomal signature sa PC1 wala maobserbahan sa transcriptome (Supplementary Figure 7B), nga nagpakita sa post-transcriptional regulation.
A. Principal component analysis (PCA) plot nga gikoloran sumala sa cytoplasmic ribosomal gene ontology (GO) nga mga termino tabok sa proteome. Ang mga pana nagpakita sa direksyon sa protein-mediated variation sa PCA plot. Ang gitas-on sa linya katumbas sa principal component score para sa usa ka gihatag nga protina. B, C. PCA feature plots para sa RPS13 ug RPL38. D. Unsupervised hierarchical clustering analysis sa cytoplasmic ribosomal proteins. E. Structural model sa 80S ribosome (PDB: 4V6X) nga nagpasiugda sa ribosomal proteins nga adunay lain-laing kadagaya sa skeletal muscle fibers. F. Ribosomal proteins nga adunay lain-laing stoichiometry nga nahimutang duol sa mRNA exit channel.
Ang mga konsepto sa ribosomal heterogeneity ug specialization gisugyot na kaniadto, diin ang presensya sa managlahing ribosome subpopulations (ribosomal heterogeneity) direktang makaimpluwensya sa protein translation sa lain-laing mga tissues32 ug cells33 pinaagi sa selective translation sa specific mRNA transcript pools34 (ribosome specialization). Aron mailhan ang mga subpopulations sa ribosomal proteins nga co-expressed sa skeletal muscle fibers, naghimo kami og unsupervised hierarchical clustering analysis sa ribosomal proteins sa proteome (Figure 3D, Supplementary Data Set 8). Sama sa gilauman, ang ribosomal proteins wala mag-cluster pinaagi sa fiber type base sa MYH. Bisan pa, among giila ang tulo ka managlahing clusters sa ribosomal proteins; ang unang cluster (ribosomal_cluster_1) gi-coregulate sa RPL38 ug busa adunay dugang nga expression sa mga fibers nga adunay positibo nga PC1 profile. Ang ikaduhang cluster (ribosomal_cluster_2) gi-coregulate sa RPS13 ug gipataas sa mga fibers nga adunay negatibo nga PC1 profile. Ang ikatulong cluster (ribosomal_cluster_3) wala magpakita og koordinado nga differential expression sa mga lanot sa skeletal muscle ug mahimong isipon nga "core" skeletal muscle ribosomal protein. Ang ribosomal clusters 1 ug 2 parehong adunay ribosomal proteins nga kaniadto gipakita nga nag-regulate sa alternative translation (pananglitan, RPL10A, RPL38, RPS19, ug RPS25) ug nakaimpluwensya sa functional development (pananglitan, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Subay sa mga resulta sa PCA, ang naobserbahan nga heterogeneous representation niining mga ribosomal protein sa mga lanot nagpakita usab og continuity (Supplementary Figure 7C).
Aron makita ang lokasyon sa heterogeneous ribosomal proteins sulod sa ribosome, migamit kami og structural model sa human 80S ribosome (Protein Data Bank: 4V6X) (Figure 3E). Human sa pag-isolate sa ribosomal proteins nga nahisakop sa lain-laing ribosomal clusters, ang ilang mga lokasyon wala magkatugma, nga nagsugyot nga ang among pamaagi napakyas sa paghatag og enrichment alang sa pipila ka mga rehiyon/fractions sa ribosome. Apan, makapainteres nga ang proporsyon sa dagkong subunit proteins sa cluster 2 mas ubos kay sa clusters 1 ug 3 (Supplementary Figure 7D). Among naobserbahan nga ang mga protina nga adunay giusab nga stoichiometry sa mga lanot sa skeletal muscle kasagaran nahimutang sa ribosome surface (Figure 3E), nga nahiuyon sa ilang abilidad sa pagpakig-uban sa internal ribosome entry site (IRES) elements sa lain-laing mRNA populations, sa ingon nag-coordinate sa selective translation. 40, 41 Dugang pa, daghang mga protina nga adunay giusab nga stoichiometry sa mga lanot sa skeletal muscle nahimutang duol sa mga functional regions sama sa mRNA exit tunnel (Figure 3F), nga selectively nga nag-regulate sa translational elongation ug arrest sa mga espesipikong peptides. 42 Sa laktod nga pagkasulti, ang among datos nagsugyot nga ang stoichiometry sa mga protina sa ribosomal sa skeletal muscle nagpakita og heterogeneity, nga miresulta sa mga kalainan tali sa mga lanot sa skeletal muscle.
Sunod namong gisugdan ang pag-ila sa mga fast- ug slow-twitch fiber signatures ug pagsuhid sa mga mekanismo sa ilang transcriptional regulation. Pinaagi sa pagtandi sa mga fast- ug slow-twitch fiber clusters nga gihubit sa UMAP sa duha ka datasets (Figures 1G–H ug 4A–B), ang transcriptomic ug proteomic analyses nakaila sa 1366 ug 804 nga lain-laing abunda nga mga feature, matag usa (Figures 4A–B, Supplementary Datasets 9–12). Among naobserbahan ang gilaumang mga kalainan sa mga signature nga may kalabutan sa mga sarcomeres (pananglitan, tropomyosin ug troponin), excitation-contraction coupling (SERCA isoforms), ug energy metabolism (pananglitan, ALDOA ug CKB). Dugang pa, ang mga transcript ug protina nga nag-regulate sa protein ubiquitination lahi nga gipahayag sa fast- ug slow-twitch fibers (pananglitan, USP54, SH3RF2, USP28, ug USP48) (Figures 4A–B). Dugang pa, ang microbial protein gene nga RP11-451G4.2 (DWORF), nga kaniadto gipakita nga lainlain ang ekspresyon sa mga tipo sa fiber sa kaunuran sa karnero43 ug nagpalambo sa kalihokan sa SERCA sa kaunuran sa kasingkasing44, miusbaw pag-ayo sa hinay nga mga fiber sa kaunuran sa kalabera (Figure 4A). Sa susama, sa indibidwal nga lebel sa fiber, nakita ang hinungdanon nga mga kalainan sa nahibal-an nga mga pirma sama sa mga isoform sa lactate dehydrogenase nga may kalabotan sa metabolismo (LDHA ug LDHB, Figure 4C ug Supplementary Figure 8A)45,46 ingon man ang wala pa mailhi nga mga pirma nga piho sa tipo sa fiber (sama sa IRX3, USP54, USP28, ug DPYSL3) (Figure 4C). Adunay usa ka hinungdanon nga pagsapaw sa lainlaing gipahayag nga mga bahin tali sa mga transcriptomic ug proteomic datasets (Supplementary Figure 8B), ingon man usa ka fold change correlation nga gimaneho labi na sa mas klaro nga lainlaing ekspresyon sa mga bahin sa sarcomere (Supplementary Figure 8C). Ilabi na, ang pipila ka mga pirma (pananglitan USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) nagpakita og kusog nga post-transcriptional regulation sa proteomic level lamang ug adunay hinay/paspas nga twitch fiber type-specific expression profiles (Supplementary Figure 8C).
A ug B mga plot sa bulkan nga nagtandi sa hinay ug paspas nga mga pungpong nga giila sa uniform manifold approximation and projection (UMAP) plots sa Figures 1G–H. Ang mga de-kolor nga tuldok nagrepresentar sa mga transcript o protina nga lahi kaayo sa FDR < 0.05, ug ang mas ngitngit nga mga tuldok nagrepresentar sa mga transcript o protina nga lahi kaayo sa log change > 1. Ang two-way statistical analysis gihimo gamit ang DESeq2 Wald test uban ang Benjamini–Hochberg adjusted p values ​​​​(transcriptomics) o ang Limma linear model method uban ang empirical Bayesian analysis gisundan sa Benjamini–Hochberg adjustment para sa daghang mga pagtandi (proteomics). C Signature plots sa pinili nga differentially expressed genes o protina tali sa hinay ug paspas nga mga lanot. D Enrichment analysis sa significantly differentially expressed transcripts ug protina. Ang nagsapaw nga mga kantidad gipayaman sa duha ka datasets, ang mga kantidad sa transcriptome gipayaman lamang sa transcriptome, ug ang mga kantidad sa proteome gipayaman lamang sa proteome. Ang statistical analysis gihimo gamit ang clusterProfiler package uban ang Benjamini-Hochberg adjusted p-values. E. Mga transcription factor nga espesipiko sa tipo sa fiber nga giila sa SCENIC base sa mga score sa regulator specificity nga nakuha sa SCENIC ug lain-laing ekspresyon sa mRNA tali sa mga tipo sa fiber. F. Pag-profile sa pinili nga mga transcription factor nga lainlain ang ekspresyon tali sa hinay ug paspas nga mga fiber.
Dayon naghimo kami og overrepresentation analysis sa lain-laing representasyon sa mga gene ug protina (Figure 4D, Supplemental Data Set 13). Ang pagpayaman sa agianan alang sa mga bahin nga lahi tali sa duha ka dataset nagpadayag sa gilauman nga mga kalainan, sama sa fatty acid β-oxidation ug ketone metabolism processes (hinay nga mga lanot), myofilament/muscle contraction (paspas ug hinay nga mga lanot, matag usa), ug carbohydrate catabolic processes (paspas nga mga lanot). Ang serine/threonine protein phosphatase activity misaka usab sa fast fibers, nga gimaneho sa mga bahin sama sa regulatory ug catalytic phosphatase subunits (PPP3CB, PPP1R3D, ug PPP1R3A), nga nailhan nga nag-regulate sa glycogen metabolism (47) (Supplemental Figures 8D–E). Ang ubang mga agianan nga gipadato sa paspas nga mga lanot naglakip sa mga lawas sa pagproseso (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) sa proteome (Supplementary Fig. 8F), nga posibleng nalambigit sa post-transcriptional regulation (48), ug transcription factor activity (SREBF1, RXRG, RORA) sa transcriptome (Supplementary Fig. 8G). Ang hinay nga mga lanot gipadato sa oxidoreductase activity (BDH1, DCXR, TXN2) (Supplementary Fig. 8H), amide binding (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Supplementary Fig. 8I), extracellular matrix (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Supplementary Fig. 8J), ug receptor-ligand activity (FNDC5, SPX, NENF) (Supplementary Fig. 8K).
Aron makakuha og dugang nga pagsabot sa transcriptional regulation nga nagpahipi sa hinay/paspas nga mga kinaiya sa klase sa muscle fiber, naghimo kami og transcription factor enrichment analysis gamit ang SCENIC49 (Supplementary Data Set 14). Daghang transcription factors ang midaghan pag-ayo tali sa paspas ug hinay nga mga fiber sa kaunuran (Figure 4E). Apil niini ang mga transcription factors sama sa MAFA, nga kaniadto nalambigit sa paspas nga paglambo sa muscle fiber,50 ingon man ang daghang mga transcription factors nga wala kaniadto nalambigit sa mga gene program nga espesipiko sa klase sa muscle fiber. Lakip niini, ang PITX1, EGR1, ug MYF6 mao ang labing midaghan nga transcription factors sa paspas nga mga fiber sa kaunuran (Figure 4E). Sa kasukwahi, ang ZSCAN30 ug EPAS1 (nailhan usab nga HIF2A) mao ang labing midaghan nga transcription factors sa hinay nga mga fiber sa kaunuran (Figure 4E). Subay niini, ang MAFA gipahayag sa mas taas nga lebel sa rehiyon sa UMAP nga katumbas sa paspas nga mga fiber sa kaunuran, samtang ang EPAS1 adunay kaatbang nga pattern sa ekspresyon (Figure 4F).
Gawas pa sa nailhan nga mga gene nga nag-code sa protina, adunay daghang mga biotype sa RNA nga dili nag-code nga mahimong nalambigit sa regulasyon sa paglambo ug sakit sa tawo. 51, 52 Sa mga transcriptome dataset, daghang mga non-coding RNA ang nagpakita sa fiber type specificity (Figure 5A ug Supplementary Dataset 15), lakip ang LINC01405, nga espesipiko kaayo alang sa hinay nga mga fiber ug gitaho nga mikunhod sa kaunuran gikan sa mga pasyente nga adunay mitochondrial myopathy. 53 Sa kasukwahi, ang RP11-255P5.3, nga katumbas sa lnc-ERCC5-5 gene (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, nagpakita sa paspas nga fiber type specificity. Ang LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) ug RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) parehong nagpakita og espesipisidad sa skeletal muscle (Supplementary Figures 9A–B) ug walay nailhan nga contractile genes sulod sa ilang 1 Mb genomic neighborhood, nga nagsugyot nga sila adunay espesyal nga papel sa pag-regulate sa mga fiber types imbes nga pag-regulate sa silingang mga contractile genes. Ang hinay/paspas nga fiber type-specific expression profiles sa LINC01405 ug RP11-255P5.3, matag usa, gikumpirma gamit ang RNAscope (Figures 5B–C).
A. Ang mga non-coding RNA transcript gi-regulate pag-ayo sa hinay ug paspas nga pagkibot nga mga lanot sa kaunuran. B. Representative nga mga imahe sa RNAscope nga nagpakita sa hinay ug paspas nga pagkibot nga tipo sa fiber nga espesipiko sa LINC01405 ug RP11-255P5.3, matag usa. Scale bar = 50 μm. C. Kwantipikasyon sa myofiber type-specific non-coding RNA expression nga gitino sa RNAscope (n = 3 ka biopsies gikan sa independente nga mga indibidwal, nga nagtandi sa paspas ug hinay nga mga lanot sa kaunuran sulod sa matag indibidwal). Ang statistical analysis gihimo gamit ang two-tailed Student's t-test. Ang mga box plot nagpakita sa median ug ang una ug ikatulo nga quartile, nga ang mga whisker nagtudlo sa minimum ug maximum nga mga kantidad. D. De novo microbial protein identification workflow (gihimo gamit ang BioRender.com). E. Ang microbial protein LINC01405_ORF408:17441:17358 espesipikong gipahayag sa hinay nga mga lanot sa kaunuran sa kalabera (n=5 ka biopsies gikan sa independente nga mga partisipante, nga nagtandi sa paspas ug hinay nga mga lanot sa kaunuran sa matag partisipante). Ang estadistikal nga pag-analisa gihimo gamit ang Limm linear model method nga giubanan sa empirical Bayesian approach, gisundan sa Benjamini-Hochberg method para sa daghang pagtandi nga adunay p-value adjustment. Ang mga box plot nagpakita sa median, una ug ikatulo nga quartile, nga adunay mga whisker nga nagtudlo sa maximum/minimum nga mga kantidad.
Bag-ohay lang, gipakita sa mga pagtuon nga daghang putative non-coding transcripts ang nag-encode sa mga transcribed microbial protein, ang uban niini nag-regulate sa muscle function. 44, 55 Aron mailhan ang mga microbial protein nga adunay potensyal nga fiber type specificity, among gipangita ang among 1000 fiber proteome dataset gamit ang custom FASTA file nga adunay mga sequence sa non-coding transcripts (n = 305) nga nakit-an sa 1000 fiber transcriptome dataset (Figure 5D). Among giila ang 197 ka microbial protein gikan sa 22 ka lain-laing transcripts, 71 niini ang lain-laing gi-regulate tali sa hinay ug paspas nga skeletal muscle fibers (Supplementary Figure 9C ug Supplementary Data Set 16). Para sa LINC01405, tulo ka microbial protein products ang giila, ang usa niini nagpakita og parehas nga slow fiber specificity sa transcript niini (Figure 5E ug Supplementary Figure 9D). Busa, among giila ang LINC01405 isip usa ka gene nga nag-encode sa usa ka microbial protein nga espesipiko para sa hinay nga skeletal muscle fibers.
Naghimo kami og komprehensibo nga workflow para sa dako nga proteomic characterization sa indibidwal nga mga fiber sa kaunuran ug giila ang mga regulator sa fiber heterogeneity sa himsog nga mga estado. Gigamit namo kini nga workflow aron masabtan kung giunsa makaapekto ang nemaline myopathies sa skeletal muscle fiber heterogeneity. Ang nemaline myopathies mga napanunod nga sakit sa kaunuran nga hinungdan sa kahuyang sa kaunuran ug, sa mga apektadong bata, adunay lainlaing mga komplikasyon lakip ang respiratory distress, scoliosis, ug limitado nga paglihok sa mga bukton. 19,20 Kasagaran, sa mga nemaline myopathies, ang mga pathogenic variant sa mga gene sama sa actin alpha 1 (ACTA1) moresulta sa pagkalabaw sa slow-twitch fiber myofiber composition, bisan kung kini nga epekto heterogeneous. Usa ka talagsaon nga eksepsiyon mao ang troponin T1 nemaline myopathy (TNNT1), nga adunay pagkalabaw sa fast fibers. Busa, ang mas maayo nga pagsabot sa heterogeneity nga nagpahiping sa skeletal muscle fiber dysregulation nga naobserbahan sa mga nemaline myopathies makatabang sa pagsulbad sa komplikado nga relasyon tali niini nga mga sakit ug sa tipo sa myofiber.
Kon itandi sa himsog nga mga kontrol (n=3 matag grupo), ang mga myofiber nga nahimulag gikan sa mga pasyente sa nemaline myopathy nga adunay mga mutasyon sa mga gene sa ACTA1 ug TNNT1 nagpakita og dakong myofiber atrophy o dystrophy (Figure 6A, Supplementary Table 3). Kini nagpresentar og dakong teknikal nga mga hagit alang sa proteomic analysis tungod sa limitado nga gidaghanon sa magamit nga materyal. Bisan pa niini, nakamatikod kami og 2485 ka protina sa 272 ka skeletal myofibers. Human sa pagsala alang sa labing menos 1000 ka gi-quantify nga protina matag fiber, 250 ka fiber ang gipailalom sa sunod nga bioinformatics analysis. Human sa pagsala, usa ka aberids nga 1573 ± 359 ka protina matag fiber ang gi-quantify (Supplementary Figure 10A, Supplementary Data Sets 17–18). Talalupangdon, bisan pa sa dakong pagkunhod sa gidak-on sa fiber, ang giladmon sa proteome sa mga sample sa pasyente sa nemaline myopathy gamay ra ang pagkunhod. Dugang pa, ang pagproseso niining datos gamit ang among kaugalingong mga FASTA file (lakip ang mga non-coding transcript) nagtugot kanamo sa pag-ila sa lima ka microbial protein sa skeletal myofibers gikan sa mga pasyente nga adunay nemaline myopathy (Supplementary Data Set 19). Ang dynamic range sa proteome mas lapad, ug ang total proteins sa control group maayo nga nakig-uban sa mga resulta sa miaging 1000-fiber proteome analysis (Supplementary Fig. 10B–C).
A. Mga mikroskopikong hulagway nga nagpakita sa pagkadaot o dystrophy sa fiber ug ang pagkadaghan sa lain-laing klase sa fiber base sa MYH sa ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathies (NM). Scale bar = 100 μm. Aron masiguro ang pagkaparehas sa pagtina sa mga pasyente sa ACTA1 ug TNNT1, tulo ka biopsy sa pasyente ang gitina duha ngadto sa tulo ka beses (upat ka seksyon matag kaso) sa dili pa mopili og representatibong mga hulagway. B. Mga proporsyon sa klase sa fiber sa mga partisipante base sa MYH. C. Principal component analysis (PCA) plot sa mga fiber sa skeletal muscle sa mga pasyente nga adunay nemaline myopathies ug mga kontrol. D. Mga fiber sa skeletal muscle gikan sa mga pasyente nga adunay nemaline myopathies ug mga kontrol nga gi-project sa usa ka PCA plot nga gitino gikan sa 1000 ka fiber nga gi-analisa sa Figure 2. Pananglitan, mga volcano plot nga nagtandi sa mga kalainan tali sa mga partisipante nga adunay ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathies ug mga kontrol, ug tali sa mga partisipante nga adunay ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathies. Ang mga lingin nga may kolor nagpakita sa mga protina nga lahi kaayo sa π < 0.05, ug ang mga itom nga tulbok nagpakita sa mga protina nga lahi kaayo sa FDR < 0.05. Ang estadistikal nga pag-analisa gihimo gamit ang Limma linear model method ug empirical Bayesian methods, gisundan sa p-value adjustment para sa daghang pagtandi gamit ang Benjamini-Hochberg method. H. Enrichment analysis sa mga protina nga lahi kaayo og ekspresyon sa tibuok proteome ug sa type 1 ug 2A fibers. Ang estadistikal nga pag-analisa gihimo gamit ang clusterProfiler package ug Benjamini-Hochberg adjusted p-values. I, J. Principal component analysis (PCA) plots nga gikoloran sa extracellular matrix ug mitochondrial gene ontology (GO) terms.
Tungod kay ang mga nemaline myopathies makaimpluwensya sa proporsyon sa mga tipo sa myofiber nga nagpahayag sa MYH sa skeletal muscle,19,20 una namong gisusi ang mga tipo sa myofiber nga nagpahayag sa MYH sa mga pasyente nga adunay mga nemaline myopathies ug mga kontrol. Gitino namo ang tipo sa myofiber gamit ang usa ka unbiased nga pamaagi nga gihulagway kaniadto alang sa 1000 myofiber assay (Supplementary Figs. 10D–E) ug napakyas na usab sa pag-ila sa puro nga 2X myofibers (Figure 6B). Nakita namo ang usa ka heterogeneous nga epekto sa mga nemaline myopathies sa tipo sa myofiber, tungod kay duha ka pasyente nga adunay mga mutasyon sa ACTA1 adunay dugang nga proporsyon sa type 1 myofibers, samtang ang duha ka pasyente nga adunay TNNT1 nemaline myopathy adunay pagkunhod nga proporsyon sa type 1 myofibers (Figure 6B). Sa tinuod lang, ang ekspresyon sa MYH2 ug fast troponin isoforms (TNNC2, TNNI2, ug TNNT3) mikunhod sa ACTA1-nemaline myopathies, samtang ang ekspresyon sa MYH7 mikunhod sa TNNT1-nemaline myopathies (Supplementary Figure 11A). Kini nahiuyon sa nangaging mga taho sa heterogeneous myofiber type switching sa nemaline myopathies.19,20 Gikumpirma namo kini nga mga resulta pinaagi sa immunohistochemistry ug nakit-an nga ang mga pasyente nga adunay ACTA1-nemaline myopathy adunay predominance sa type 1 myofibers, samtang ang mga pasyente nga adunay TNNT1-nemaline myopathy adunay kaatbang nga pattern (Figure 6A).
Sa lebel sa single-fiber proteome, ang mga lanot sa kalabera sa kaunuran gikan sa mga pasyente nga adunay ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathy nag-cluster uban sa kadaghanan sa mga control fiber, diin ang mga lanot sa TNNT1 nemaline myopathy sa kinatibuk-an mao ang labing grabe nga naapektuhan (Figure 6C). Kini labi nga makita sa pag-plot sa mga principal component analysis (PCA) plot sa pseudo-inflated fibers alang sa matag pasyente, diin ang mga pasyente nga adunay TNNT1 nemaline myopathy 2 ug 3 ang makita nga labing layo gikan sa mga control sample (Supplementary Figure 11B, Supplementary Data Set 20). Aron mas masabtan kung giunsa pagtandi ang mga lanot gikan sa mga pasyente nga adunay myopathy sa himsog nga mga lanot, gigamit namo ang detalyado nga impormasyon nga nakuha gikan sa proteomic analysis sa 1,000 ka mga lanot gikan sa himsog nga mga partisipante sa hamtong. Gi-project namo ang mga lanot gikan sa myopathy dataset (mga pasyente ug kontrol sa ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathy) ngadto sa PCA plot nga nakuha gikan sa 1000-fiber proteomic analysis (Figure 6D). Ang distribusyon sa mga tipo sa MYH fiber subay sa PC2 sa control fibers parehas sa distribusyon sa fiber nga nakuha gikan sa 1000-fiber proteomic analysis. Bisan pa, kadaghanan sa mga fiber sa mga pasyente nga adunay nemaline myopathy mibalhin paubos sa PC2, nga nagsapaw sa himsog nga fast-twitch fibers, bisan unsa pa ang ilang lumad nga tipo sa MYH fiber. Busa, bisan kung ang mga pasyente nga adunay ACTA1 nemaline myopathy nagpakita og pagbalhin padulong sa type 1 fibers sa dihang gi-quantify gamit ang mga pamaagi nga nakabase sa MYH, ang ACTA1 nemaline myopathy ug TNNT1 nemaline myopathy parehong nagbalhin sa skeletal muscle fiber proteome ngadto sa fast-twitch fibers.
Among gitandi dayon ang matag grupo sa pasyente sa himsog nga mga kontrol ug giila ang 256 ug 552 nga lainlain nga gipahayag nga mga protina sa ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathies, matag usa (Figure 6E–G ug Supplementary Figure 11C, Supplementary Data Set 21). Ang pag-analisa sa pagpayaman sa gene nagpadayag sa usa ka koordinado nga pagkunhod sa mga protina sa mitochondrial (Figure 6H–I, Supplementary Data Set 22). Katingad-an, bisan pa sa lainlaing pagkalabaw sa mga tipo sa fiber sa ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathies, kini nga pagkunhod hingpit nga independente sa tipo sa fiber nga nakabase sa MYH (Figure 6H ug Supplementary Figures 11D–I, Supplementary Data Set 23). Tulo ka microbial protein ang gi-regulate usab sa ACTA1 o TNNT1 nemaline myopathies. Duha niining mga microprotein, ang ENSG00000215483_TR14_ORF67 (nailhan usab nga LINC00598 o Lnc-FOXO1) ug ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), nagpakita og lain-laing kadaghanon lamang sa type 1 myofibers. Ang ENSG00000215483_TR14_ORF67 gitaho kaniadto nga adunay papel sa regulasyon sa cell cycle. 56 Sa laing bahin, ang ENSG00000232046_TR1_ORF437 (katumbas sa LINC01798) misaka sa type 1 ug type 2A myofibers sa ACTA1-nemaline myopathy kon itandi sa himsog nga mga kontrol (Supplementary Figure 12A, Supplementary Data Set 24). Sa kasukwahi, ang mga ribosomal nga protina wala kaayo maapektuhan sa nemaline myopathy, bisan kung ang RPS17 mikunhod sa regulasyon sa ACTA1 nemaline myopathy (Fig. 6E).
Ang pag-analisa sa pagpausbaw nagpadayag usab sa pag-usbaw sa mga proseso sa immune system sa ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathy, samtang ang cell adhesion misaka usab sa TNNT1 nemaline myopathy (Figure 6H). Ang pagpausbaw niining mga extracellular factor gipakita sa extracellular matrix proteins nga nagbalhin sa PCA sa PC1 ug PC2 sa negatibo nga direksyon (ie, padulong sa labing apektadong mga fiber) (Figure 6J). Ang duha ka grupo sa pasyente nagpakita sa dugang nga ekspresyon sa extracellular proteins nga nalambigit sa immune responses ug sarcolemmal repair mechanisms, sama sa annexins (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 ug ang ilang interacting protein S100A1159 (Supplementary Figures 12B–C). Kini nga proseso gitaho kaniadto nga gipauswag sa muscular dystrophies60 apan, sa among nahibaloan, wala pa kaniadto nalangkit sa nemaline myopathies. Ang normal nga function niining molecular machinery gikinahanglan alang sa sarcolemmal repair human sa kadaot ug alang sa paghiusa sa bag-ong naporma nga myocytes uban sa myofibers58,61. Busa, ang dugang nga kalihokan niini nga proseso sa duha ka grupo sa mga pasyente nagsugyot og usa ka reparative nga tubag sa kadaot nga gipahinabo sa kawalay kalig-on sa myofiber.
Ang mga epekto sa matag nemaline myopathy maayo ang correlation (r = 0.736) ug nagpakita og makatarunganon nga overlap (Supplementary Figures 11A–B), nga nagpakita nga ang ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathy adunay parehas nga epekto sa proteome. Bisan pa, ang pipila ka mga protina gi-regulate lamang sa ACTA1 o TNNT1 nemaline myopathy (Supplementary Figures 11A ug C). Ang profibrotic protein nga MFAP4 usa sa labing gi-upregulate nga mga protina sa TNNT1 nemaline myopathy apan nagpabilin nga wala mausab sa ACTA1 nemaline myopathy. Ang SKIC8, usa ka component sa PAF1C complex nga responsable sa pag-regulate sa HOX gene transcription, gi-downregulate sa TNNT1 nemaline myopathy apan wala maapektuhan sa ACTA1 nemaline myopathy (Supplementary Figure 11A). Ang direktang pagtandi sa ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathy nagpakita og mas dakong pagkunhod sa mitochondrial proteins ug pagtaas sa immune system proteins sa TNNT1 nemaline myopathy (Figure 6G–H ug Supplementary Figures 11C ug 11H–I). Kini nga datos nahiuyon sa mas dakong atrophy/dystrophy nga naobserbahan sa TNNT1 nemaline myopathy kon itandi sa TNNT1 nemaline myopathy (Figure 6A), nga nagsugyot nga ang TNNT1 nemaline myopathy nagrepresentar sa mas grabe nga matang sa sakit.
Aron masusi kung ang naobserbahan nga mga epekto sa nemaline myopathy nagpadayon ba sa tibuok lebel sa kaunuran, naghimo kami og bulk proteomic analysis sa mga biopsies sa kaunuran gikan sa parehas nga cohort sa mga pasyente nga adunay TNNT1 nemaline myopathy ug gitandi kini sa mga kontrol (n=3 matag grupo) (Supplementary Fig. 13A, Supplementary Data Set 25). Sama sa gilauman, ang mga kontrol suod nga nalambigit sa principal component analysis, samtang ang mga pasyente nga adunay TNNT1 nemaline myopathy nagpakita og mas taas nga intersample variability nga susama sa nakita sa single fiber analysis (Supplementary Fig. 13B). Ang bulk analysis nagpakita sa lain-laing mga protina nga gipahayag (Supplementary Fig. 13C, Supplementary Data Set 26) ug mga proseso sa biyolohikal (Supplementary Fig. 13D, Supplementary Data Set 27) nga gipasiugda pinaagi sa pagtandi sa indibidwal nga mga lanot, apan nawad-an sa abilidad sa pag-ila tali sa lainlaing mga tipo sa lanot ug napakyas sa pag-asoy sa heterogeneous nga mga epekto sa sakit sa mga lanot.
Kon tan-awon sa kinatibuk-an, kini nga datos nagpakita nga ang single-myofiber proteomics makapatin-aw sa mga klinikal nga biyolohikal nga bahin nga dili mamatikdan sa mga gitarget nga pamaagi sama sa immunoblotting. Dugang pa, kini nga datos nagpasiugda sa mga limitasyon sa paggamit sa actin fiber typing (MYH) lamang aron ihulagway ang phenotypic adaptation. Sa tinuud, bisan kung ang fiber type switching managlahi tali sa actin ug troponin nemaline myopathies, ang duha ka nemaline myopathies nagbulag sa MYH fiber typing gikan sa metabolismo sa fiber sa kaunuran sa kalabera padulong sa usa ka mas paspas ug dili kaayo oxidative nga muscle proteome.
Ang heterogeneity sa selula hinungdanon aron matubag sa mga tisyu ang ilang lainlaing mga panginahanglan. Sa kaunuran sa kalabera, kini kanunay nga gihulagway nga mga tipo sa fiber nga gihulagway sa lainlaing mga degree sa produksiyon sa kusog ug kakapoy. Bisan pa, klaro nga kini nagpatin-aw lamang sa gamay nga bahin sa pagkalainlain sa fiber sa kaunuran sa kalabera, nga labi ka lainlain, komplikado ug multifaceted kaysa kaniadto nga gihunahuna. Ang mga pag-uswag sa teknolohiya karon naghatag kahayag sa mga hinungdan nga nag-regulate sa mga fiber sa kaunuran sa kalabera. Sa tinuud, ang among datos nagsugyot nga ang type 2X fibers mahimong dili usa ka lahi nga subtype sa fiber sa kaunuran sa kalabera. Dugang pa, among giila ang mga metabolic protein, ribosomal protein ug mga protina nga nalangkit sa selula isip mga nag-unang determinant sa heterogeneity sa fiber sa kaunuran sa kalabera. Pinaagi sa pag-apply sa among proteomic workflow sa mga sample sa pasyente nga adunay nematode myopathy, among gipakita pa nga ang MYH-based fiber typing wala hingpit nga nagpakita sa heterogeneity sa kaunuran sa kalabera, labi na kung ang sistema nabalda. Sa tinuud, bisan unsa pa ang tipo sa fiber nga nakabase sa MYH, ang nematode myopathy moresulta sa pagbalhin ngadto sa mas paspas ug dili kaayo oxidative fibers.
Ang mga lanot sa kaunuran sa kalabera giklasipikar sukad pa sa ika-19 nga siglo. Ang bag-o nga mga pag-analisa sa omics nagtugot kanato sa pagsugod sa pagsabot sa mga profile sa ekspresyon sa lainlaing mga tipo sa MYH fiber ug ang ilang mga tubag sa lainlaing mga stimuli. Sama sa gihulagway dinhi, ang mga pamaagi sa omics adunay usab bentaha sa mas dako nga pagkasensitibo alang sa pag-ihap sa mga marker sa tipo sa fiber kaysa sa tradisyonal nga mga pamaagi nga nakabase sa antibody, nga wala magsalig sa pag-ihap sa usa (o pipila) nga mga marker aron mahibal-an ang usa ka tipo sa lanot sa kaunuran sa kalabera. Gigamit namo ang mga komplementaryong transcriptomic ug proteomic workflows ug gihiusa ang mga resulta aron susihon ang transcriptional ug post-transcriptional nga regulasyon sa heterogeneity sa fiber sa mga lanot sa kaunuran sa kalabera sa tawo. Kini nga workflow miresulta sa kapakyasan sa pag-ila sa puro nga 2X-type nga mga lanot sa lebel sa protina sa vastus lateralis sa among cohort sa himsog nga mga batan-ong lalaki. Kini nahiuyon sa nangaging mga pagtuon sa single fiber nga nakit-an nga <1% puro nga 2X fibers sa himsog nga vastus lateralis, bisan kung kini kinahanglan nga kumpirmahon sa ubang mga kaunuran sa umaabot. Ang kalainan tali sa pag-ila sa hapit puro nga 2X fibers sa lebel sa mRNA ug ang gisagol nga 2A/2X fibers lamang sa lebel sa protina makapalibog. Ang ekspresyon sa MYH isoform mRNA dili circadian,67 nagsugyot nga dili tingali nato "nasipyat" ang signal sa pagsugod sa MYH2 sa daw puro nga 2X fibers sa lebel sa RNA. Usa ka posibleng katin-awan, bisan tuod puro hypothetical, mahimong mga kalainan sa kalig-on sa protina ug/o mRNA tali sa mga isoform sa MYH. Sa tinuud, walay paspas nga fiber nga 100% puro alang sa bisan unsang isoform sa MYH, ug dili klaro kung ang lebel sa ekspresyon sa MYH1 mRNA sa 70-90% nga range moresulta sa parehas nga kadagaya sa MYH1 ug MYH2 sa lebel sa protina. Bisan pa, kung gikonsiderar ang tibuuk nga transcriptome o proteome, ang pag-analisa sa cluster masaligon nga makaila lamang sa duha ka managlahing cluster nga nagrepresentar sa hinay ug paspas nga mga fiber sa kaunuran sa kalabera, bisan unsa pa ang ilang tukma nga komposisyon sa MYH. Kini nahiuyon sa mga pag-analisa gamit ang single-nucleus transcriptomic approaches, nga kasagaran makaila lamang sa duha ka managlahing myonuclear clusters. 68, 69, 70 Dugang pa, bisan tuod ang nangaging mga pagtuon sa proteomic nakaila sa type 2X fibers, kini nga mga fibers wala magtapok nga gilain gikan sa ubang mga fast fibers ug nagpakita lamang og gamay nga gidaghanon sa lain-laing gidaghanon sa mga protina nga daghan kon itandi sa ubang mga tipo sa fiber base sa MYH. 14 Kini nga mga resulta nagsugyot nga kinahanglan kitang mobalik sa sayong bahin sa ika-20 nga siglo nga panan-aw sa klasipikasyon sa muscle fiber, nga nagbahin sa mga fiber sa skeletal muscle sa tawo dili ngadto sa tulo ka managlahing klase base sa MYH, apan ngadto sa duha ka cluster base sa ilang metabolic ug contractile properties. 63
Mas importante, ang myofiber heterogeneity kinahanglan nga tagdon sa daghang mga dimensyon. Ang nangaging mga pagtuon sa "omics" nagtudlo niini nga direksyon, nga nagsugyot nga ang mga lanot sa skeletal muscle wala magporma og discrete clusters apan gihan-ay subay sa usa ka continuum. 11, 13, 14, 64, 71 Dinhi, among gipakita nga, dugang pa sa mga kalainan sa contractile ug metabolic properties sa skeletal muscle, ang mga myofiber mahimong mailhan pinaagi sa mga bahin nga may kalabutan sa cell-cell interactions ug translation mechanisms. Sa tinuud, nakit-an namon ang ribosome heterogeneity sa mga lanot sa skeletal muscle nga nakatampo sa heterogeneity nga independente sa hinay ug paspas nga mga tipo sa fiber. Ang nagpahiping hinungdan niining dakong myofiber heterogeneity, nga independente sa hinay ug paspas nga tipo sa fiber, nagpabilin nga dili klaro, apan kini mahimong magtudlo sa espesyal nga spatial organization sulod sa mga muscle fascicle nga labing maayo nga motubag sa piho nga mga pwersa ug mga karga,72 espesyal nga cellular o organ-specific nga komunikasyon sa ubang mga tipo sa cell sa muscle microenvironment73,74,75 o mga kalainan sa ribosome activity sulod sa indibidwal nga myofibers. Sa tinuod lang, ang ribosomal heteroplasmy, pinaagi man sa paralogous substitution sa RPL3 ug RPL3L o sa lebel sa 2′O-methylation sa rRNA, napamatud-an nga nalangkit sa skeletal muscle hypertrophy76,77. Ang multi-omic ug spatial nga mga aplikasyon inubanan sa functional characterization sa indibidwal nga myofibers mas mopalambo sa atong pagsabot sa muscle biology sa multi-omic level78.
Pinaagi sa pag-analisar sa mga proteome sa single myofibers gikan sa mga pasyente nga adunay nemaline myopathies, among gipakita usab ang gamit, kaepektibo, ug pagka-aplikar sa single myofiber proteomics aron maklaro ang klinikal nga pathophysiology sa skeletal muscle. Dugang pa, pinaagi sa pagtandi sa among workflow sa global proteomic analysis, among napamatud-an nga ang single myofiber proteomics naghatag sa parehas nga giladmon sa impormasyon sama sa global tissue proteomics ug nagpalapad niini nga giladmon pinaagi sa pag-isip sa interfiber heterogeneity ug myofiber type. Gawas pa sa gilauman (bisan pa man nga variable) nga mga kalainan sa fiber type ratio nga naobserbahan sa ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathies kon itandi sa himsog nga mga kontrol,19 among nakita usab ang oxidative ug extracellular remodeling nga independente sa MYH-mediated fiber type switching. Ang Fibrosis gitaho na kaniadto sa TNNT1 nemaline myopathies.19 Bisan pa, ang among pag-analisar gibase niini nga nakaplagan pinaagi sa pagpadayag usab sa dugang nga lebel sa extracellular secreted stress-related proteins, sama sa mga annexin, nga nalambigit sa mga mekanismo sa pag-ayo sa sarcolemmal, sa mga myofibers gikan sa mga pasyente nga adunay ACTA1 ug TNNT1 nemaline myopathies.57,58,59 Sa konklusyon, ang pagtaas sa lebel sa annexin sa mga myofibers gikan sa mga pasyente nga adunay nemaline myopathy mahimong magrepresentar sa usa ka cellular response sa pag-ayo sa grabe nga atrophic myofibers.
Bisan tuod kini nga pagtuon nagrepresentar sa pinakadako nga single-fiber whole-muscle-omics analysis sa mga tawo hangtod karon, dili kini walay mga limitasyon. Gilain namo ang mga lanot sa kalabera sa kaunuran gikan sa medyo gamay ug homogenous nga sample sa mga partisipante ug usa ka kaunuran (ang vastus lateralis). Busa, imposible nga isalikway ang paglungtad sa piho nga mga populasyon sa lanot sa lainlaing mga tipo sa kaunuran ug sa mga tumoy sa pisyolohiya sa kaunuran. Pananglitan, dili nato isalikway ang posibilidad sa usa ka subset sa ultrafast fibers (pananglitan, puro nga 2X fibers) nga mitumaw sa mga highly trained sprinter ug/o mga atleta sa kusog79 o sa mga panahon sa pagkadili aktibo sa kaunuran66,80. Dugang pa, ang limitado nga gidak-on sa sample sa mga partisipante nakapugong kanamo sa pag-imbestiga sa mga kalainan sa sekso sa heterogeneity sa lanot, tungod kay ang mga ratio sa tipo sa lanot nahibal-an nga lahi tali sa mga lalaki ug babaye. Dugang pa, wala kami makahimo sa pagpahigayon sa transcriptomic ug proteomic analyses sa parehas nga mga lanot sa kaunuran o mga sample gikan sa parehas nga mga partisipante. Samtang kami ug ang uban nagpadayon sa pag-optimize sa single-cell ug single-myofiber analyses gamit ang omics analysis aron makab-ot ang ultra-low sample input (sama sa gipakita dinhi sa pag-analisa sa mga fiber gikan sa mga pasyente nga adunay mitochondrial myopathy), ang oportunidad sa paghiusa sa multi-omics (ug functional) nga mga pamaagi sulod sa single muscle fibers nahimong klaro.
Sa kinatibuk-an, ang among datos nag-ila ug nagpatin-aw sa mga transcriptional ug post-transcriptional nga mga hinungdan sa heterogeneity sa skeletal muscle. Sa piho, among gipresentar ang datos nga naghagit sa dugay nang dogma sa pisyolohiya sa skeletal muscle nga nalangkit sa klasikal nga MYH-based nga kahulugan sa mga tipo sa fiber. Nanghinaut kami nga mabag-o ang debate ug sa katapusan mahunahuna pag-usab ang among pagsabot sa klasipikasyon ug heterogeneity sa fiber sa skeletal muscle.
Napulog upat ka mga partisipante nga Caucasian (12 ka lalaki ug 2 ka babaye) ang boluntaryong miuyon nga moapil niini nga pagtuon. Ang pagtuon giaprobahan sa Ethics Committee sa Ghent University Hospital (BC-10237), misunod sa 2013 Helsinki Declaration, ug narehistro sa ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Ang kinatibuk-ang mga kinaiya sa mga partisipante gipresentar sa Supplementary Table 1. Human makakuha og berbal ug sinulat nga informed consent, ang mga partisipante gipailalom sa medikal nga eksaminasyon sa wala pa ang katapusang paglakip sa pagtuon. Ang mga partisipante batan-on (22–42 ka tuig), himsog (walay medikal nga kondisyon, walay kasaysayan sa pagpanigarilyo), ug kasarangan nga aktibo sa pisikal. Ang labing taas nga oxygen uptake gitino gamit ang step ergometer alang sa pagtimbang-timbang sa pisikal nga kahimsog sama sa gihulagway kaniadto. 81
Ang mga sample sa muscle biopsy gikolekta sa pagpahulay ug sa pagpuasa tulo ka beses, nga may gilay-on nga 14 ka adlaw. Tungod kay kini nga mga sample gikolekta isip kabahin sa usa ka mas dako nga pagtuon, ang mga partisipante mikonsumo og placebo (lactose), usa ka H1-receptor antagonist (540 mg fexofenadine), o usa ka H2-receptor antagonist (40 mg famotidine) 40 minutos sa wala pa ang biopsy. Among gipakita kaniadto nga kini nga mga histamine receptor antagonist wala makaapekto sa kahimsog sa kaunoran sa kalabera sa pagpahulay81, ug walay nakitang state-related clustering sa among quality control plots (Supplementary Figures 3 ug 6). Usa ka standardized nga pagkaon (41.4 kcal/kg gibug-aton sa lawas, 5.1 g/kg carbohydrate sa gibug-aton sa lawas, 1.4 g/kg protina sa gibug-aton sa lawas, ug 1.6 g/kg tambok sa gibug-aton sa lawas) ang gipadayon sulod sa 48 ka oras sa wala pa ang matag adlaw sa eksperimento, ug usa ka standardized nga pamahaw (1.5 g/kg carbohydrate sa gibug-aton sa lawas) ang gikaon sa buntag sa adlaw sa eksperimento. Ubos sa local anesthesia (0.5 ml 1% lidocaine nga walay epinephrine), ang mga muscle biopsy gikuha gikan sa vastus lateralis muscle gamit ang percutaneous Bergström aspiration.82 Ang mga sample sa kaunuran gisulod dayon sa RNA ug gitipigan sa 4°C hangtod sa manual fiber dissection (hangtod sa 3 ka adlaw).
Ang bag-ong nahimulag nga mga bugkos sa myofiber gibalhin ngadto sa presko nga RNAlater medium sa usa ka culture dish. Ang indibidwal nga mga myofiber dayon gi-dissect gamit ang stereomicroscope ug pino nga sipit. Baynte singko ka mga lanot ang gi-dissect gikan sa matag biopsy, nga naghatag ug espesyal nga atensyon sa pagpili sa mga lanot gikan sa lainlaing mga lugar sa biopsy. Human sa dissection, ang matag lanot hinayhinay nga gituslob sa 3 μl nga lysis buffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) nga adunay proteinase K ug DNase enzymes aron makuha ang dili gusto nga mga protina ug DNA. Ang cell lysis ug pagtangtang sa protina/DNA gisugdan dayon pinaagi sa mubo nga vortexing, pagtuyok sa likido sa usa ka microcentrifuge, ug incubation sa temperatura sa kwarto (10 min). Ang lysate dayon gi-incubate sa usa ka thermal cycler (T100, Bio-Rad) sa 37°C sulod sa 5 min, 75°C sulod sa 5 min, ug dayon gitipigan dayon sa -80°C hangtod sa dugang nga pagproseso.
Ang mga Illumina-compatible polyadenylated RNA libraries giandam gikan sa 2 µl sa myofiber lysate gamit ang QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Makita ang detalyadong mga pamaagi sa manwal sa tiggama. Ang proseso magsugod sa first-strand cDNA synthesis pinaagi sa reverse transcription, diin ang unique molecular identifiers (UMIs) ug sample-specific i1 barcodes gipaila aron masiguro ang pag-pool sa mga sample ug pagpakunhod sa teknikal nga variability atol sa downstream processing. Ang cDNA gikan sa 96 ka myofibers dayon gi-pool ug gi-purified gamit ang magnetic beads, pagkahuman ang RNA gikuha ug ang second-strand synthesis gihimo gamit ang random primers. Ang library gi-purified gamit ang magnetic beads, gidugang ang pool-specific i5/i7 tags, ug gi-amplified ang PCR. Ang katapusang lakang sa purification nagpatungha og mga Illumina-compatible libraries. Ang kalidad sa matag library pool gisusi gamit ang High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Base sa Qubit quantification, ang mga pool gi-pool pa sa equimolar concentrations (2 nM). Ang resulta nga pool gi-sequence dayon sa usa ka NovaSeq 6000 instrument sa standard mode gamit ang NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nucleotides) nga adunay 2 nM loading (4% PhiX).
Ang among pipeline gibase sa Lexogen's QuantSeq Pool data analysis pipeline (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Ang datos unang gi-demultiplex gamit ang bcl2fastq2 (v2.20.0) base sa i7/i5 index. Ang Read 2 gi-demultiplex dayon gamit ang idemux (v0.1.6) base sa i1 sample barcode ug ang mga UMI sequence gi-extract gamit ang umi_tools (v1.0.1). Ang mga read gi-trim dayon gamit ang cutadapt (v3.4) sa daghang rounds aron matangtang ang mga mubo nga read (<20 ang gitas-on) o mga read nga gilangkoban lamang sa mga adapter sequence. Ang mga read gi-align dayon sa human genome gamit ang STAR (v2.6.0c) ug ang mga BAM file gi-index gamit ang SAMtools (v1.11). Ang mga duplicate read gitangtang gamit ang umi_tools (v1.0.1). Sa katapusan, ang alignment counting gihimo gamit ang featureCounts sa Subread (v2.0.3). Ang pagkontrol sa kalidad gihimo gamit ang FastQC (v0.11.9) sa pipila ka mga yugto sa pipeline.
Ang tanang dugang nga pagproseso ug pag-visualize sa bioinformatics gihimo sa R ​​(v4.2.3), panguna gamit ang Seurat (v4.4.0) workflow. 83 Busa, ang indibidwal nga mga kantidad sa UMI ug mga metadata matrice gibag-o ngadto sa mga butang nga Seurat. Ang mga gene nga gipahayag sa wala pay 30% sa tanang mga fiber gikuha. Ang mga sample nga ubos ang kalidad gikuha base sa minimum nga threshold nga 1000 ka mga kantidad sa UMI ug 1000 ka mga gene nga nakita. Sa katapusan, 925 ka mga fiber ang nakapasar sa tanang mga lakang sa pagsala sa kalidad. Ang mga kantidad sa UMI gi-normalize gamit ang pamaagi sa Seurat SCTransform v2, 84 lakip ang tanang 7418 ka mga nakit-an nga bahin, ug ang mga kalainan tali sa mga partisipante gi-regress. Ang tanang may kalabutan nga metadata makita sa Supplementary Dataset 28.